PCR法是20世纪80年代中期建立的体外DNA扩增实验，基本原理是DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在的酶DNA合成反应。就是通过DNA聚合酶的作用来放大DNA链。该实验具有灵敏度高、特异性强、检测快的特点，但对实验环境要求严格、实验成本高，有时还会出现假阳性现象。
(a)材料和设备
支原体PCR检测试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶、缓冲溶液、琼脂糖、矿物油、超顺工作台、PCR仪器、电气岭东、凝胶图像分析系统、台式离心机、旋流混合器等。
(b)程序
1收集样品。测试大象细胞用无双抗培养液培养7d，用无菌容器提取清液500 L，以4保存。
2.制作模板。在无菌状态下采集细胞，用无菌0.5毫升塑料离心管盖上盖子，用95水浴加热5min。
3.打开盖子，将StrataClean Resin 10l放入管子中，盖上盖子，混合旋流悬浮液，离心5~ 10s，在新型塑料离心管上吸收上清，完成模板制作，4存放。
4.PCR反应。反应系统的最佳条件如下：10mmol/l tris-HCI (ph 8.38)、50mmol/l kci、1.5 ~ 2.5 mmol/l MGC L2、200 m ol/l dntp、2u TP
(1)在0.5毫升塑料离心管中加入35.2l去离子水和5l 10 xTaq反应缓冲液。
(2)依次添加0.4l dNTP (25mmol/L)、0.4l Taq酶(5U/l)、2l引物等成分。
(3)加上2l去离子水，总体积为45l。
(4)将5l制成的模板添加到反应系统中。
(5)两性控制，内大角度5l添加到各自的反应体系中。
(6)取1个含有上述反应体系的离心管，将5l去离子水加入语音控制管。
(7)在反应系统中加入100l矿物油。
(8)PCR程序见表1。
程序
周期数
温度()
时间(分钟)
1
1
94
2
50
2
72
2
2
40
94
1
50
1
72
2
琼脂糖凝胶电动岭东。PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为2%。电泳结束后凝胶图像分析结果。
6.结果分析。该方法是检验支原体的定性方法，在电泳通道中，根据标志物、阳性控制和内对照，会出现不同的电泳带。验尸样品通道上出现亮带，位置在阳性对照和耐对比带位置之间，则认为该样品被支原体污染。
有时会发现一条赛道上出现多个，可能是这个样品感染了2种以上的支原体造成的。如果莱恩内的属相隐约出现，怀疑有支原体污染，可以重新制作这个样品。
(c)注意事项
PCR反应的前期工作应在无菌环境下进行。假阳性，假阴性，有时要反复多次。
